pull down實驗檢測測試的簡單介紹

pull down實驗檢測測試的詳細信息

樣品要求

蛋白樣品-80℃保存，干冰寄送，下單前請先和工作人員溝通，確認測試細節。

常見問題

為什么會有假陽性的結果出現？

由于內源性蛋白的干擾，高純度的GST融合蛋白能夠減少實驗的假陽性。由于高純度的融合蛋白能減少實驗結果的假陽性，因此獲得高純度的融合蛋白對于GST-pull down 實驗結果 分析具有重要的作用。同時，為了能夠程度的保證融合蛋白原有的生物學活性，一般在獲取融合蛋白時傾向于可溶性融合蛋白，因此獲得高純度的可溶性蛋白很關鍵。 對于可溶性蛋白的獲得條件主要有載體的選擇。可溶性蛋白表達條件的選擇，誘導溫度，誘導時間，誘導物的濃度，能夠不被細胞代謝而且具有穩定的濃度。

DNA pull down 常見問題

1：適配子DNA單鏈，可以用帶有互補鏈的磁珠進行pull down嗎？如果可以，效率怎么樣？一般需要怎么優化條件？

理論上說,若DNA單鏈能夠與磁珠上的互補鏈雜交成功,是可以進行pull down實驗的; 效率如何不好確定,這個取決于兩條DNA單鏈是否能雜交成功、蛋白-DNA結合的強弱、蛋白的豐度等。

2：DNA pull down的 原理？

針對目標區域設計特異性DNA探針并進行生物素標記，生物素探針可與偶聯在磁珠上的鏈霉親和素結合；細胞蛋白提取物與磁珠-DNA探針孵育，從而釣取與DNA探針有特異性結合的互作蛋白質。

3：你們對外服務的檢測項目有哪些？

細胞、動物/植物組織、菌體都可以做DNA pull down, 我們還可以做的檢測實驗具體如下:

(1) RNA-蛋白/RNA互作及定位：RNA pull down、RIP、fish等;

(2) DNA-蛋白互作：DNA pull down、ChIP、EMSA、雙熒光素酶、酵母單雜等;

(3) 蛋白-蛋白互作：GST/his pull down、CoIP、酵母雙雜等;

(4) 細胞學檢測：細胞增殖-MTT/CCK-8, 細胞凋亡, 細胞周期,細胞遷移、侵襲：劃痕愈合/Transwell/Transwell（Matrigel）等;

(5) 外泌體服務：提取、鑒定(Nanosight粒徑檢測/電鏡/WB)、

測序(miRNA/lncRNA)、蛋白質組學;

(6) 轉錄組及蛋白質組：真核有參轉錄組、無參轉錄組、真核lncRNA、small RNA等。

4：效率有多高？

效率主要取決于蛋白-DNA結合的強弱、蛋白的豐度等。

5：老師，對照組的DNA序列是怎么選擇的？

一般對照組是沒有探針的,對照組是磁珠beads+蛋白。

6：DNA pull down有什么缺陷嗎？

DNA pull down-MS是體外研究蛋白-DNA是否有直接互作的經典技術，是將探針結合在凝膠/磁珠上，釣取與DNA探針有互作的蛋白；就技術而言,沒有明顯的缺陷;后續質譜能鑒定到多少蛋白取決于蛋白-DNA結合的強弱、蛋白的豐度等。

7：做DNA pulldown 用DNA單鏈好還是雙鏈好？

常規的是用DNA雙鏈作為探針。

8：可以簡單講一下生物素標記引物的原理嗎？

主要利用生物素（biotin）和親和素（avidin）這兩種分子的獨特性質; 親和素的每個亞基都能結合一個生物素分子,兩者的結合是通過生物素的脲基環部分完成的;因此可將其戊suan側鏈通過酰胺鍵與核酸分子相連，構成生物素標記的核酸探針

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